Técnicas de Reprodução Assistida

Nilson Donadio, Nilka Fernandes Donadio

Introdução

As técnicas de Reprodução Assistida Laboratorialmente incluem principalmente aquelas que manipulam unicamente os gametas masculinos, depositando-os preparados em algum ponto do genital feminino e, sem dúvida, aquelas que ovócitos e espermatozoides são assistidos laboratorialmente, sendo depois transferidos zigotos ou pré-embriões consequentes.

A reprodução animal e humana artificial ou manipulada devem ser reportadas a “priscas eras” (Carvalho, 1987)1. Assim a manipulação de “ovos de mamíferos”, melhor seria dizer pré-embriões, ocorrera no século passado. Heape, em 18912, transplantou com sucesso pré-embrião do oviduto de uma coelha para o útero de outra espécie angorá. Lavados uterinos ou tubários, de diferentes animais, contendo pré-embriões são atualmente trabalhados de rotina na veterinária. Transferem-se, assim, pré-embriões bovinos, de doadoras de excelente qualidade, para úteros de outras vacas de menor valor, mas melhor adaptadas ou resistentes, visando a preservar e a reproduzir aquelas de melhor estirpe.

A intromissão do homem na natureza ficou mais patente na obtenção de pré-embriões juntando espermatozoides e óvulos. Assim, Chang3, em 1959, teve sucesso na fertilização in vitro, denominada também inseminação in vitro, juntando gametas de coelhos.

Aceita-se, como primeira fertilização in vitro humana (FIV) bem-sucedida, apesar de ter ocorrido gestação tubária, aquela de Steptoe e Edwards, em 19764. Inaugurou aquele trabalho a obtenção de ovócitos por via laparoscópica depois de estímulo ovárico com gonadotrofinas humanas extraídas da urina de mulher menopausada (HMG).

Tem ficado omitido das referências, motivo de cartas entre autores da revista Fertility and Sterility, o pioneirismo de Raoult Palmer, na obtenção de ovócitos em laparoscopia, presenciada por Steptoe em Paris antes de seus trabalhos na Inglaterra. Palmer desenvolveu a laparoscopia facilitando muito a obtenção de óvulos antes feita por laparotomia. Por nosso lado, estagiando nesse serviço, em 1965-1966, no Hospital Broca de Paris, acompanhamos essa evolução da endoscopia e obtenção de gametas diretamente dos ovários in vivo.

A conquista do chamado “primeiro bebê de proveta” foi auspiciosa e ansiosamente comunicada para a mídia e por carta (letter) através da revista Lancet, pelos seus autores, Steptoe e Edwards, 19784. Marcou uma corrida mundial. O respectivo nascimento de Louise Brow, em 1978, forçou intercâmbios e congressos entre os países europeus. Louise Brow surgiu a partir da captação de ovócito em ciclo espontâneo, enquanto se pretendia ser melhor estimular os ovários e manipular no laboratório maior número de ovócitos possível. Uma constelação de pesquisadores desenvolviam melhores condições para o preparo de gametas no laboratório. Grupos australianos insistiram na obtenção de ovócitos pela superovulação medicamentosa e também na maturação prévia, em cultura, antes de inseminá-los in vitro (Trounson et al., 1981)5.

Na América do Sul, muitos serviços iniciaram trabalhos e publicaram ou informaram à mídia seus primeiros resultados em FIV. No Brasil, resultados surgiram desde 1982-1983, no Centro Biológico de Reprodução Humana da Santa Casa Santa Isabel de São Paulo, quanto a instalação de laboratórios e pesquisa animal (Donadio et al., 1984)6,7, também quanto a nascimentos (Donadio et al., 1984)7. As novas técnicas foram rapidamente assimiladas em nosso meio. Assim, o congelamento de gametas ou pré-embriões, ovodoação, útero-substituto, gestações em mulheres menopausadas e micromanipulações de ovócitos, com a introdução de um único espermatozoide nos citoplasmas (ICSI). O ICSI, sem dúvida, com a obtenção de espermatozoides viáveis diretamente do epidídimo ou testículos, que logo aplicamos, revolucionou a abordagem clínica e cirúrgica dos casais com problemas de fertilidade conjugal.

Todas essas alternativas, em conjunto chamadas Reprodução Assistida, ART – Artificial Reproductive Technologies –, RA – Reprodução Assistida –, mais os diagnósticos pré-implantatórios nos pré-embriões (Handsyde et al., 1990)8 ocupam lugar definitivo nas condutas alternativas ou indicações primárias. Teme-se mesmo uma desumanização da reprodução pela expansão exagerada, até amoral, das indicações, culminando na produção dos embriões “clones” humanos e seres híbridos como fonte de órgãos e tecidos. Obtenção de gravidez com a estrita finalidade de interrompê-la, visando a utilizar os tecidos fetais para outros fins, até mesmo ovócitos, de suas gônadas, para novas gestações. No lado positivo, o genoma humano, mapeamento de nossos cromossomos e seus determinismos, em fase final de pesquisa, melhorará o diagnóstico das anormalidades e prognósticos pré-implantatórios, por meio de biópsias. Estas permitem a seleção de embriões que poderão ser transferidos, enquanto os outros serão desprezados ou utilizados para pesquisas em serviços éticos autorizados.

Nesta publicação, no capítulo de ética nas técnicas de reprodução assistida, veremos os esforços e os problemas de normatizar, moralizar e legislar para se manter o respeito à espécie humana. Umas das proposições que fazemos, antecipando aquele capítulo, é sugerir ao Conselho Federal de Medicina e ao Congresso Nacional que fique obrigatório, compulsório, poderem os pré-embriões congelados serem doados após um prazo curto de dois anos, independentemente e apesar dos progenitores genéticos. Mantidos congelados por tempo indeterminado até que se consigam receptores, salvo se deixarem disposições em contrário, renováveis e aceitas ética e legalmente pelo médico. Importante que a criopreservação permaneça na responsabilidade do casal progenitor (genético). Que o Congresso determine a criação de Comissão Independente e Permanente para Técnicas de Reprodução Assistida, sob os auspícios do Conselho Federal de Medicina, participando dela leigo com problemas de fertilidade conjugal ou sociedade que o represente, o presidente da Comissão de Reprodução Assistida da Febrasgo, reconhecida pela Associação Médica Brasileira, ainda um representante da Sociedade Brasileira de Reprodução Humana (SBRH), sociedade existente há 50 anos, além de urologista, geneticista, neonatologista, havendo 50% de elementos femininos daquelas e outras especialidades médicas ou sociais.

Fig. 67-1. Um dos embriões transferidos em 1983, redundando na primeira gestação a termo no CBRH – Centro Biológico de Reprodução Humana Santa Casa Santa Isabel de São Paulo. Imagem mostra pré-embrião com 4 blastômeros, 48 horas depois de FIV convencional. Sobre a zona pelúcida, espermatozoides ainda aderidos. Grupo de células granulosas restantes. Pré-embrião tipo A (ou 4), ideal para transferência ou criopreservação. Sem bubbles ou restos citoplasmáticos, blastômeros iguais com membranas regulares. (Donadio et al., 1986)

Divisões das técnicas de Reprodução Laboratorialmente Assistida (RA). Transporte de gametas e Pré-embriões. Mudanças na abordagem básica Clínica e Cirúrgica dos casais.

Divisão das Técnicas

Veremos que os gametas masculinos e femininos podem ser obtidos por diferentes métodos e depois manipulados para seleção e aquisição de capacidade para promoverem a formação de pré-embriões em cultura ou nas trompas. E, assim, gestações a término. A maioria dos procedimentos aplicáveis é isolada ou associada a outros tratamentos.

Inseminação Artificial Clássica in Vivo, Vaginal e Cervical

Manuseia-se sêmen total, isto é, o ejaculado, sem separar do “plasma seminal” os espermatozoides. Este material é depositado na vagina ou nunca além do canal cervical uterino pela presença de diferentes antígenos e outros elementos figurados. É a inseminação clássica ou médica que será detalhada quanto às indicações variantes técnicas.

As amostras seminais são obtidas frescas por qualquer método, masturbatório em recipientes próprios, após coito, da vagina ou de condon, ou descongeladas de bancos de sêmen. A mulher tem trompas permeáveis ou consideradas suficientes. Captam elas normalmente os óvulos para interação fisiológica ampolar com os gametas artificialmente depositados, que migram desde o canal cervical. Realmente, os gametas podem ser depositados no fundo-de-saco vaginal ou no canal endocervical. Uso de caps reservatórios com sêmen total são aplicáveis envolvendo a “portio”.

Denomina-se inseminação artificial clássica ou convencional como “homóloga” (IAH) ou “heteróloga” (IAD), conforme a amostra seminal do marido ou de doador, respectivamente. Não se considera ético a inseminação mista, os dois tipos de materiais misturados e depois inseminados.

Inseminação Artificial ou Médica Clássica in Vivo Além do Canal Cervical Uterino

Difere das anteriores pela seleção e capacitação dos espermatozoides que são inseminados, após manipulação em meio de cultura, livres do plasma seminal, dos elementos antigênicos e outras células. Também as amostras são do marido ou homólogas (IAH), sêmen fresco ou descongelado e de doador (IAD). Na IAD, as amostras doadas, e mesmo seus doadores, sofrem seleções e quarentenas, sendo rejeitados os materiais frescos para uso imediato, sob o risco de infecções transmissíveis. Discutem-se proventos econômicos nas doações, o assim o chamado “marketing sêmen”.

Há muitas variantes entre as inseminações além do canal cervical: (a) Inseminação Intracorporal Fúndica Uterina, a mais usada; (b) intratubária; (c) intraperitoneal; (d) intraovárica-folicular. As duas últimas atualmente excepcionalmente aplicadas. Veremos as indicações, vias de introdução e deposições dos gametas capacitados previamente e outros detalhes técnicos de cada procedimento, em capítulo apropriado desta publicação. Também os esquemas de superovulação, visando à captura pelas trompas de maior número de ovócitos, nos ciclos com uma única inseminação ou repetidas, num mesmo estímulo ou em vários meses, nos períodos periovulatórios monitorizados.

As inseminações também são chamadas de inseminações médicas terapêuticas para diferenciá-las das veterinárias (Netter, A. 1974)9b.

GIFT, Gametes Intra-Fallopian Transfer: Transferência de Gametas Masculinos e Femininos para as Trompas.

Gametas separados ou juntos na mesma gota de meio, após seleções e capacitações. Técnica denominada GIFT – gametes intra-fallopian transfer, transferência intratubária de gametas (Asch et al., 1985)10.

Em ciclos espontâneos ou medicados se obtêm ovócitos para imediatamente transferi-los com espermatozoides para as trompas, em um único procedimento cirúrgico, laparoscópico, laparotômico ou minilaparotômico. Atualmente a capacitação dos ovócitos é feita mais frequentemente e previamente pela via transvaginal, com guia ultrassonográfico. Esse procedimento é aplicado durante diagnóstico ou tratamento do fator tuboperitoneal e endometriose. O GIFT, excepcionalmente, é completado pela transferência para as trompas via transcervical transuterina.

ZIFT ou PROST, Zigoto Intra-Fallopian Transfer e TET, Tubal Embryo-Transfer (Yovich et al., 1990)

Obtidos os ovócitos, estes interagem em cultura com espermatozoides até serem penetrados. Então, assim, “fertilizados”, como zigotos pronucleados (presença do pronúcleo masculino e do pronúceo feminino) são depositados nas trompas por via laparoscópica convencional, mini ou microlaparoscópica (semiambulatorial), laparotômica ou outras vias, intervenções essas ocorrendo aproximadamente 24 horas após captura dos óvulos ou da “inseminação in vitro”, caracterizando o ZIFT (Devroey et al., 1986)11. Mantendo gametas interagindo em cultura por mais tempo antes da transferência, ocorre divisão do zigoto, dita clivagem. Este procedimento é denominado TET – tubal embryo transfer. Observa-se que no ZIFT ou TET manipulam-se embriões. No caso de GIFT, unicamente gametas , situação “mais aceitável pela igreja”.

IVF-ET, in Vitro Fertilization and Embryo Transfer. FIVETE Convencional (FIV Convencional)

Nesta técnica, os ovócitos são inseminados in vitro como no ZIFT e TET, porém, transferem-se pré-embriões para o útero e não para as trompas. Pré-embriões com dois, quatro ou mais blastômeros, transferidos 50 a 70 horas após a inseminação in vitro. Logo não interessando a permeabilidade tubária, embora possa haver gestações ectópicas pelos refluxos, assim como eventual influência nefasta de hidrossalpíngeo na implantação.

Certifica-se de ter havido na sequência laboratorial a penetração do espermatozoide pela presença pronúcleos femininos e masculinos, depois a divisão mais avançada, antes da transferência para a cavidade uterina, geralmente por via transcervical.

FIVETE com Microinseminações, FIVETE, ZIFT e TET com Técnicas de Micromanipulações

Preconiza-se nelas facilitar a aproximação entre os gametas ou ultrapassar fenômenos das interações naturais que ocorrem antes da “fecundação propriamente dita”. Acreditamos que a penetração do espermatozoide no citoplasma, em si, não traduz a fertilização. No ooplasma precisa ocorrer a descondensação da cabeça do espermatozoide, transformação em pronúcleo, aproximação e fusão com o pronúcleo feminino, constituindo uma única estrutura. O aparecimento do pronúcleo feminino é induzido pelo espermatozoide, surgindo também o segundo corpúsculo polar, ao lado do primeiro que havia no ovócito em metáfase II. Temos a fertilização a partir da singamia ou imediata divisão do ovócito em dois ou mais blastômeros com 2n cromossomos. A presença do espermatozoide ou seu núcleo no ooplasma não significa que sofrerá a descondensação e transformação em pronúcleo masculino que se fusionará ao feminino. Importante salientar que um único espermatozoide pode se transformar em dois pronúcleos. Também que os blastômeros precisam ter núcleos com 2n cromossomos, contendo material genético paterno para confirmarmos ser zigoto. A manipulação, às vezes, provoca divisão partenogenética com formação de blastômeros sem material paterno. Duas estruturas separadas, cada uma com n cromossomos, não significa pré-embrião, o processo pode estagnar-se nessa fase. Em animais, trocam-se pronúcleos, sem perda da possibilidade de fusão.

FIVETE, ZIFT e TET com Microinseminação in Vitro

Facilita-se a aproximação dos espermatozoides e a dispersão das células granulosas que envolvem os ovócitos obtidos, criando-se microespaços, em microgotas ou microcâmaras artificiais dentro das placas de cultura.

FIVETE, ZIFT e TET em Micromanipulação

1.  Com DRILLING, PZD (Gordon et al., 1998)13 Otimiza-se a penetração espontânea do espermatozoide no espaço subzonal, através da zona pelúcida, fragilizando-a por diferentes métodos. A PZD – partial zone dissection (Malter et al.,1989)14 foi, no passado, a técnica mais usada e complexa que aplicamos também no Brasil, em 1989, com raros resultados (Donadio et al., 1990)15. Pretende-se nela que os gametas masculinos penetrem espontaneamente pelos orifícios na zona pelúcida. Essa fragilização pode ser feita por agentes físicos e químicos, “Drillings”.
2. Com SUZI – suzonal insemination (Laws-King et al., 1987)16 Depositam-se gametas masculinos diretamente no espaço subzonal expandido artificialmente. Muito frequentemente substituída pela ICSI, apesar dos bons resultados.
3. Com ICSI – intracytoplasmatic sperm injection (Lanzendorf et al., 1988)17 Auspiciosamente, por fim, ressurgiu em 1992 (Palermo et al., 1992)18, com pleno sucesso, a FIVETE e Micromanipulação com “ICSI – intracytoplasmatic sperm injection”. Injeção de um espermatozoide dentro do citoplasma do ovócito.

Revolucionou os resultados de FIVETE com fator masculino. Resultados espetaculares, quase(?) que independentes da forma e número dos gametas selecionados, obtidos de ejaculadas ou diretamente dos genitais masculinos, dês canais deferentes durante reanastomoses, do epidídimo e dos testículos, técnicas essas denominadas TESA (Silber et al., 1998)19, MESA (Tourrnaye et al., 1994)20 e PESA (Shrivastav et al., 1994)21 transcutâneas ou microcirúrgicas, que detalharemos. Gametas para uso imediato ou para criopreservação.

O núcleo ou todo um gameta e inserido no citoplasma de ovócito maduro denudado artificialmente, livre então das células granulosas. O espermatozoide introduzido se transforma em pronúcleo masculino, participando de toda a interação necessária para ocorrer a fertilização propriamente dita, isto é, a fusão com o pronúcleo feminino.

Assim, a microinseminação, as micromanipulações, Drilling, PZD, SUZI, ICSI, principalmente as três últimas técnicas, utilizando micromanipuladores, facilitam ou ultrapassam as sequências naturais do processo de fecundação que ocorre nos genitais femininos. Então, temos basicamente a FIVETE convencional e a FIVETE com micromanipulações e os embriões transferidos para o útero. Outras facilitações têm sido tentadas para promover a nidificação, considerada problemática devido ao endométrio ou pré-embrião, uma delas denominada “Hatching Artificial” (Cohen et al., 1990)22. Com micromanipulação, agora de pré-embriões antes de transferi-los, perfura-se ou se fragiliza a zona pelúcida.

Usando microagulhas e micromanipuladores, podemos também retirar blastômeros inativos, bolhas citoplasmáticas, enfim, tenta-se melhorar pré-embriões (Fig. 67-2)

Fig. 67-2. “ART – FIV, GFT, TET, micromanipulação

 Associações das Técnicas Compatíveis, nas Sequências desde IAH, IAD, GIFT, ZIFT, TET, FIVETE

Num mesmo ciclo podemos realizar, por exemplo, inseminações médicas terapêuticas, mais GIFT, também FIVETE convencional e FIVETE com ICSI etc. Quando no futuro for possível congelar óvulos, poderemos aplicar técnicas diferentes em outro lote de ovócitos de mesmo ciclo, frente a resultado anterior insatisfatório.

 Criopreservações Preventivas

Normalmente, a criopreservação tem sido usada para pré-embriões supranumerários, mas é preconizada também em situações especiais.

Congelamento de gametas ou de pré-embriões para futuros imediatos ou tardios mais adequados. Quando de imediato existem inconvenientes gerais ou genitais, síndrome de hiperestímulo, endométrio lesado, endométrio provavelmente não adequado por ocasião de transferências ou visando a programas de ovodoações.

Modernamente aplicam-se criopreservações desejando evitar-se perder a chance de futuras gravidezes normais com seus próprios gametas. Mulheres se submetem “em tempo” (antes dos 35 anos de idade) a ovócito-captação transvaginal, fertilização por amostras de banco de sêmen e congelamento dos pré-embriões. Garantem transferências futuras, sem os riscos de malformados, devido a ovócitos envelhecidos nos ovários. Dependendo do convencimento ético-moral dos médicos e das pacientes, essa hipótese deveria ser aventada previamente a cirurgias radicais por neoplasias malignas com perda de ovários e de útero. Os pré-embriões poderiam oportunamente ser transferidos para útero substituto de parentes ou beneficentes. Atualmente, a autocriopreservação de óvulos não funciona bem com o congelamento de espermatozoides ou de pré-embriões. Vários ejaculados são preservados, antes de terapêuticas ou cirurgias no homem, deletérias para a espermiogênese ou complicadoras da ejaculação. Infelizmente, muitas vezes, esses cuidados são esquecidos mesmo por pacientes médicos.

Critica-se a autocriopreservação de gametas simplesmente para escapar das vicissitudes das infecções sexualmente transmissíveis, autocriopreservação social.

Variantes Técnicas menos Utilizadas

Em clínica de fertilidade, cateterismos tubários durante HSG ou US, tuboscopias, faloposcopias e as técnicas de reprodução laboratorialmente assistida, substituíram 80% de nossas antigas laparotomias e laparoscopias isoladas nos diferentes fatores de subfertilidade ou esterilidade conjugal. Procura-se exaustivamente se adaptar aos procedimentos clássicos a RA e, inclusive, inventivas oportunas associações de métodos. São adaptações atendendo o momento cirúrgico ou clínico do caso e, frequentemente, o estado técnico do laboratório. Descrevem-se assim variantes técnicas na ART com denominações que traduzem manipulações de gametas ou pré-embriões, simplificadas oportunamente, durante intervenções clínico-cirúrgicas primariamente indicadas:

1. DIPI – direct intraperitoneal insemination (1985)(Manhes et al., 1985)23
2. SET – surgical embryo transfer, via transparietal uterina através da uretra ou vagina (1987) (Parsons et al., 1987)24
3. POST – peritoneal oocyte transfer (1987)(Sharma et al., 1987)25
4. TUFT – transuterine fallopian transfer, por cateterismo (1987)(Jansen et al., 1987)26
5. DOT – direct oocyte transfer (1990)(Craft et al., 1990)27
6. “PROST e ZIFT”, que não se diferenciam, antes descritas.
7. “TET e TEST”, que também não se diferenciam, antes descritas.

 Transporte de Gametas e Pré-Embriões: Popularização da RA

Desde que se mantenham as condições adequadas de temperatura (37 graus centígrados) e se evitem grandes mudanças de pH e osmolaridade, os líquidos foliculares ou meios de cultura com gametas e/ou pré-embriões podem ser transportados dos locais onde foram obtidos para um laboratório comunitário e vice-versa.

Acrescenta-se que as facilidades de unidades móveis laboratoriais, transportando gametas e embriões (Donadio et al., 1995)28, de clínicas, hospitais ou day hospitals, para centros especializados, ou mesmo estacionados (veículos motorizados equipados) popularizam os procedimentos (Dzik, A, 1996)29.

A pulverização de laboratórios em todo o País levaria, sem dúvida, a problemas de controle pela sociedade ou entidades responsáveis quanto à ética e qualidade dos serviços prestados. O transporte na RA permite que se atendam, sem restrições socioeconômicas, casais de nosso imenso território. Calcula-se, na América Latina, que 1,5 milhão de casais devem se beneficiar da RA, considerando a idade reprodutiva entre 18 e 40 anos. Têm-se 8%-12% de casais inférteis, dependendo da região e do tempo de expectativa e de casamento considerado; 5% a 20% precisam de RA como alternativa para conseguir filhos próprios. Acrescentando-se as criopreservações preventivas de indicação médica e as sociais, o transporte viabiliza e democratiza esses cuidados. Entendendo-se a falta de crianças para adoção, aquele expediente permite a colocação de pré-embriões em todo o território nacional. Promove intercâmbio, forçando padronizações e estendendo as maiores possibilidades técnicas a centros menos desenvolvidos. (Fig. 67-3)

Fig. 67-3. Transportador 110 (220) e 12 V. Controle de temperatura e gasável. Para gametas e pré-embriões (Pro-embryo).